Nanotechnologia

Michał Kadlof,
Warszawa 20 IX 2020 r.

artykuł laureata konferencji Sympozjum Młodych Naukowców 2020

Każda z naszych komórek (nie licząc czerwonych krwinek) zawiera w swoim jądrze wierną kopię naszego genomu. Genom ten jest złożony z ok. 6-ciu miliardów par zasad azotowych splecionych w podwójnej helisie kwasu DNA i zorganizowany jest w 46-ciu cząsteczkach zwanych chromosomami. Cząsteczki te, gdyby je wyciągnąć i ułożyć jedna z drugą miałyby łączną długość 2 metrów! Gdyby połączyć ze sobą chromosomy ze wszystkich komórek naszego ciała jego łączna długość osiągnęła by zawrotną wartość bliską 12 jednostek astronomicznych (1 a.u. to średnia odległość ziemi od słońca i wynosi 149’597’870 km). Jeszcze bardziej niezwykłe jest to, że te dwa metry kwasu DNA upakowane są wewnątrz jądra komórkowego, które ma zaledwie od kilku do kilkunastu mikrometrów średnicy. A ludzie nie są tutaj wcale rekordzistami. Rośliny i niektóre pierwotniaki mogą mieć genom o znacznie większych rozmiarach.

Rodzi to naturalne pytanie: jak to możliwe, że cząsteczki o tak wielkich rozmiarach zamknięte w tak małej objętości mogą efektywnie podlegać transkrypcji (tzn. ekspresji genów) i replikacji (powieleniu przy podziale komórki) i nie ulegać przy tym splątaniu?

Odpowiedzią na to pytanie jest złożona, wielopoziomowa organizacja genomu. Na pierwszym poziomie jest to kwas DNA tworzący podwójną helisę. Ta długa nić nawinięta jest na liczne białka zwane histonami. Oglądane pod mikroskopem przypominają paciorki nanizane na nić.      Na kolejnych poziomach organizacji nić układa się w pętle mniejszych i większych rozmiarów. Co więcej, mniejsze pętle mogą wyrastać z większych, tworząc strukturę hierarchiczną o cechach fraktalnych. Ponadto histony podlegają pewnym modyfikacjom chemicznym takim jak np. acetylacje lub metylacje. Histony o podobnym wzorcu znaczników mają tendencję do łączenia się w grupy, co tworzy obszary tzw. domen chromatynowych.

Ciekawy jest również sam mechanizm tworzenia się pętli chromatynowych. Szczególnie ważne są tutaj dwa białka – CTCF oraz kompleks kohezynowy. Kohezyna tworzy pierścień, przez który wywlekana jest nić i proces ten trwa do momentu, aż pierścień natrafi na białko CTCF – bloker pierścienia przyczepiony bezpośrednio do nici DNA. Ważna jest przy tym orientacja motywu CTCF na nici, albowiem w jedną stronę pierścień kohezynowy może przejść, zaś w przeciwną jest blokowany.

A zatem wyłania nam się obraz niezwykle dynamicznej, skomplikowanej a jednocześnie wysoce uporządkowanej struktury, rządzonej przez procesy fizyko-polimerowe, chemiczne i biologiczne

W jaki sposób można badać jej strukturę i czy możliwe jest przewidzenie dokładnej struktury 3D tak jak to ma miejsce w przypadku np. białek?

Obecnie podstawowymi metodami do badania struktury genomu są eksperymenty Hi-C i ChIA-PET. Pozwalają one na odczytanie, które fragmenty włókna chromatynowego są ze sobą w kontakcie. Wyniki tych eksperymentów są najczęściej przedstawiane w formie kwadratowych macierzy na których osiach są współrzędne chromosomów, a na przecięciu wiersza z kolumną jest zapisana informacja o tym jak często w eksperymencie zaobserwowano kontakt odpowiadającym ich miejsc. Na ich podstawie bioinformatycy starają się wydedukować jaka jest struktura 3D cząsteczki. W tym miejscu warto sobie jeszcze raz uzmysłowić rozmiary z jakimi mierzymy się w mikroświecie. Rozdzielczość eksperymentu Hi-C wynosi 1000 par zasad. To znaczy, że jeden piksel na mapie kontaktów oznacza, że kontakt jest gdzieś na odcinku 1000 par zasad  (dla porównania motyw sekwencyjny do którego wiąże się białko CTCF to zaledwie ok 20 par zasad). W przypadku takiej mapy różnica skal między spojrzeniem na cały chromosom a zejściem do poziomu pojedynczych interakcji jest jak różnica między spojrzeniem na całą planetę i zejściem do poziomu pojedynczych budynków.

A więc jak można wykorzystać mapy kontaktów do budowy modelu przestrzennego struktury jądra komórkowego?

Istnieje wiele metod. Jedną z nich jest skalowanie wielowymiarowe, którego zasadę działania najprościej jest wyjaśnić na przykładzie. W każdym atlasie drogowym znajduje się tabela z odległościami pomiędzy większymi miastami. Skalowanie wielowymiarowe jest taką transformacją matematyczną, które na podstawie takiej tabeli może odtworzyć położenia miast względem siebie (z dokładnością do obrotów i odbić lustrzanych). Mówiąc ściślej, na podstawie macierzy odległości (lub ogólniej – podobieństw) algorytm znajduje taką reprezentację punktów w przestrzeni N-wymiarowej, dla których te odległości są najwierniej odwzorowane. W tym miejscu uważny czytelnik zauważy, że macierz kontaktów, to przecież nie jest to samo co macierz odległości czy podobieństw! Czy można przekształcić jedną w drugą? Można i to nawet na wiele sposobów. Jednym z nich jest zastosowanie fizyki polimerów. Znając jej prawa można zauważyć, że częstość kontaktów jest ściśle związana z odległością. Stosując proste prawo matematyczne (zwane prawem potęgowym), można przeliczyć częstości kontaktów na odległości. Inną metodą jest zastosowanie teorii grafów. Jeśli skonstruujemy graf taki, że jego wierzchołkami będą kolejne odcinki chromatyny, a krawędziami będą połączone te odcinki, które wchodzą ze sobą w interakcję, to macierz kontaktów możemy potraktować jako macierz sąsiedztwa grafu. Wówczas możemy bardzo prosto policzyć odległości wyrażone w liczbie węzłów jakie musimy pokonać wzdłuż krawędzi po pokonać ścieżkę z węzła A do B.

Taka macierz odległości grafowych to oczywiście nie to samo co fizyczne odległości, ale okazuje się, że zbudowane na jej podstawie modele są zaskakująco spójne z innymi metodami.

Inną metodą budowania modelu 3D jest zastosowanie mechaniki molekularnej. W technice tej polimer jest reprezentowany w postaci grupy połączonych ze sobą punktów. Każda symulacja musi od się od czegoś zacząć i zazwyczaj strukturą początkową jest polimer o konformacji wygenerowanej losowo. Następnie do takiego polimeru dodawane są dalekozasięgowe  oddziaływania harmoniczne (lub pisząc prościej, kulki dla których zidentyfikowany kontakty w eksperymentach Hi-C / ChIA-PET są łączone wirtualną sprężyną). Na taki układ patrzymy od strony fizycznej, tzn. tak jakby miał pewną energię wewnętrzną wyrażoną dobrze określoną funkcją matematyczną. Znajdując miniumum takiej funkcji jesteśmy w stanie odnaleźć konformację o najmniejszej energii, tzn taką w której wszystkie sprężyny uległy ściągnięciu (mówiąc językiem fizyki – osiągnęły stan równowagi).

Mechanika molekularna pozwala nam na znajdowanie stanów o najniższej energii, ale możliwe jest zastosowanie w następnym kroku symulacji dynamiki molekularnej. Dzięki której możemy badać ewolucję układu w czasie. Ta technika pozwala nam niezwykle precyzyjnie sterować oddziaływaniami jakie mają miejsce w naszej symulacji. To tworzy pole do uwzględniania  kolejnych typów danych jakie są dla nas dostępne. Np możemy uwzględniać dane z eksperymentów  ChIP-Seq dostarczających informację o znakowaniu chemicznym chromatyny. Możemy także dodać również informację z bezpośredniego obrazowania mikroskopowego (np. mikroskopii super-rozdzielczej STED lub elektronowej EMISH). Taki obraz 3D jest traktowany jako dodatkowy wkład energetyczny do naszego symulowanego polimeru. Każda kulka naszego polimeru „odczuwa” dodatkową siłę pchającą ją w kierunku obszarów gęstych (w mikroskopii uwidocznionych w postaci jaśniejszych punktów). Dzięki temu w naszej symulacji możemy uzyskać model, który jest zgodny zarówno z danymi dot. kontaktów, jak również z danymi dotyczącymi kształtu 3D jak i danymi z eksperymentów dostarczających danych o znakowaniu epigenomicznym.

Do czego można wykorzystać taki model?

Ostatecznym celem modelowania jest stworzenie modelu o wartości predykcyjnej, tzn takiego na podstawie którego możliwe będzie przewidywanie istotnych biologicznie wniosków. Przykładowo naszym celem jest możliwość przewidzenia poziomu ekspresji genów jak zajść może na skutek uszkodzenia jednego z miejsc wiązań białek CTCF. Uszkodzenie takiego miejsca implikuje niemożność powstania pewnej konkretnej pętli na nici, a to z kolei zmienia dostępność wzmacniaczy transkrypcji (tzw. enhancer) dla miejsc inicjujących transkrypcję (promotorów). Gdy enchancer nie może się spotkać z promotorem może dojść do upośledzenia ekspresji genów, a to z kolei może się stać mechanizmem chorobotwórczym.